DNA-lajitunnisteet tulivat laajalti tiedeyhteisön tietoisuuteen vuonna 2003, kun Paul Hebert tutkijatovereineen käytti termiä DNA barcoding ensimmäistä kertaa (Hebert ym. 2003). Reilun kymmenen vuoden aikana DNA-lajitunnisteita on käsitelty useissa sadoissa tieteellisissä artikkeleissa, ja menetelmä on vakiinnuttanut paikkansa soveltavassa ekologisessa tutkimuksessa, monimuotoisuustutkimuksessa ja taksonomiassa. DNA-lajitunniste, tai DNA-viivakoodi, on eläimillä mitokondrion geenijakso COI (cytochrome c oxidase 1), kasveilla ja sienillä yhtä universaalia "viivakoodigeeniä" ei ole. Lyhyesti sanottuna DNA-lajitunnisteiden idea on seuraava: kullakin lajilla on oma ja ainutkertainen viivakoodigeenin emäsparijärjestys. Ideaalitilanteessa lajin kaikkien yksilöiden vaihtelu DNA-lajitunnisteen suhteen on pieni, mutta lähimpään lajiin verrattuna ero on sen verran iso, että lajien välillä ei ole päällekäisyyttä (ns. barcoding gap). Lajien molekulaarista määrittämistä varten täytyy ensin luoda jonkinlainen laadukas tietokanta tai referenssikirjasto, johon uusia näytteitä verrataan. Tällainen tietokanta ja samalla analyysityökalu on BOLD eli Barcode of Life Database. Jos menetelmä toimii, on tulevaisuudessa kenen tahansa mahdollista määrittää luotettavasti mikä tahansa eliö, mistä tahansa kudosnäytteestä.
On tietysti selvää, että elävän luonnon suunnaton monimuotoisuus ei ole aina luokiteltavissa yksiselitteisesti eri lajeihin, ei ainakaan samojen kriteerien mukaisesti (esimerkiksi biologinen lajikäsite ei sovi neitseellisesti lisääntyvin lajeihin). Lajiutuminen on jatkuva prosessi, jossa eristyneet populaatiot voivat ajan saatossa muodostua omiksi lajeikseen, suvuikseen tai korkeammiksi taksoneiksi. Esimerkiksi Galapagossaarten darwininsirkut ovat saariryhmälle kotoperäisiä lintuja, joita ei tavata missään muualla. Kun merestä nousseille ensimmäisille saarille oli Etelä-Amerikan mantereelta tai Karibialta lentänyt darwininsirkkujen kantamuoto (ryhmä lintuja tai pienimmillään yksi hedelmöittynyt naaras), ei kantamuodon ja lähtöpopulaation välillä ollut minkäänlaista eroa. Vuosituhansien saatossa, eristyneenä lähtöpopulaatiosta, luonnonvalinnan ja sattuman seurauksena darwininsirkut ovat muodostuneet meidän tuntemiksemme linnuiksi. Jos kuitenkin matkustaisimme ajassa taaksepäin ja pääsisimme seuraamaan sirkkujen evoluutiota, olisi meidän mahdoton yksiselitteisesti sanoa milloin ensimmäisen darwininsirkun saattaisi luokitella omaksi lajikseen. Sama prosessi on käynnissä tänäkin päivänä: on monia maantieteellisesti enemmän tai vähemmän eristäytyneitä populaatioita, joita taksonomit kutsuvat muodoiksi tai alalajeiksi. Tästä syystä lajien rajaaminen isossa maantieteellisessä mittakaavassa ei aina ole helppoa (Kuva 1). Sen sijaan paikallisesti, pienessä maantieteellisessä mittakaavassa, lajien yksiselitteinen määrittäminen ei ole tavallisesti ongelmallista. Esimerkiksi jos selvitetään Urho Kekkosen kansallispuiston kovakuoriaislajisto, asiantuntijoiden pään vaivana ovat pitkät etäisyydet, logistiikka ja suuret näytemäärät, ei eristyneiden populaatioiden "ongelma".
Vaikka DNA-lajitunnisteet ovat erinomainen lisä perinteisen taksonomian ja lajien määrittämisen rinnalle, on turha luulla että kaikki lajien määrittämiseen tai rajaamiseen liittyvät ongelmat olisivat tämän menetelmän avulla ratkaistut. Mitään yhtä tiettyä lajien välistä hyppäystä (barcoding gap) ei ole olemassa, mutta tyypillisesti lajien sisäinen vaihtelu on huomattavasti lajien välistä vaihtelua pienempää (ks. esim. Wiemers & Fiedler 2007, Pentinsaari ym. 2014). DNA-lajitunnisteiden avulla on kuitenkin huomattu niin sanottuja kryptisiä lajeja, joita on vaikea erottaa perinteisin morfologisin menetelmin, tai on havaittu, että eri nimellä kulkeneet lajit ovatkin yhtä ja samaa (Burns ym. 2008, Puillandre ym. 2011, Huemer ym. 2014).
Vaikka DNA-lajitunnisteet ovat erinomainen lisä perinteisen taksonomian ja lajien määrittämisen rinnalle, on turha luulla että kaikki lajien määrittämiseen tai rajaamiseen liittyvät ongelmat olisivat tämän menetelmän avulla ratkaistut. Mitään yhtä tiettyä lajien välistä hyppäystä (barcoding gap) ei ole olemassa, mutta tyypillisesti lajien sisäinen vaihtelu on huomattavasti lajien välistä vaihtelua pienempää (ks. esim. Wiemers & Fiedler 2007, Pentinsaari ym. 2014). DNA-lajitunnisteiden avulla on kuitenkin huomattu niin sanottuja kryptisiä lajeja, joita on vaikea erottaa perinteisin morfologisin menetelmin, tai on havaittu, että eri nimellä kulkeneet lajit ovatkin yhtä ja samaa (Burns ym. 2008, Puillandre ym. 2011, Huemer ym. 2014).
Yksi hyvä esimerkki DNA-lajitunnisteiden menestyksellisestä soveltamisesta on Turun yliopiston tutkijan Eero Vesterisen ja hänen kollegoidensa tutkimus vesisiipan ravintokohteista (Vesterinen ym. 2013). Eero ja kumppanit keräsivät 37 papanaa 34 vesisiippayksilöltä ja eristivät DNA:n papanoista käyttäen ns. uuden sukupolven sekvensointimenetelmää. Saatuja geenipätkiä verrattiin julkisiiin tietokantoihin (BOLD ja GenBank) sekä FINBoL-hankkeen puitteissa kerättyyn verrokkiaineistoon. Vesisiipat olivat käyttäneet ravintokohteinaan 128 eri niveljalkaislajia, tärkeimpiä ravintokohteita olivat kaksisiipiset (erityisesti surviaissääsket), vesiperhoset ja perhoset. Huomionarvoista tutkimuksessa on, että lepakon ravintokohteet on mahdollista määrittää lajitasolle ulosteista. Pelkkää morfologiaa käyttäen lajitason määrittäminen olisi mahdotonta, sen verran vähän hyönteisistä on jäljellä lepakon ruoansulatuksen jälkeen.
Edellä mainittu FINBoL-hanke on ollut Oulun yliopiston eläinmuseon intendentin Marko Mutasen johtama. Minullakin on ollut onni osallistua hankkeeseen, ja siitä on ollut suurta hyötyä. Olen käyttänyt hankeen avulla aikaan saatuja tuloksia kahden tieteelle uuden vaaksiaislajin kuvauksessa (Pilipenko ym. 2012, Salmela ym. 2014). Näitä kahta julkaisua lukuun ottamatta hankkeet tulokset ovat jääneet hyödyntämättä, ja vaaksiaisten parissa tehty työ jäi lojumaan BOLDin tietokantaan. Pitkästä aikaa kirjauduin BOLDiin katsomaan mitä aineisto pitää sisällään. Alla esitän joitakin havaintoja ja tuloksia, joita on toki pidettävä tässä vaiheessa alustavina.
- Sekvensoitavaksi on lähetetty 1176 vaaksiaisyksilöä, joista tuloksena 915 onnistunutta viivakoodia (pituus yli 400 emäsparia, standardipituus on 658 emäsparia). Ylivoimaisesti suurin osa yksilöistä Suomesta (1061), muutamia kymmeniä muualta Euroopasta, Aasiasta tai Pohjois-Amerikasta
- 340 lajia (pääasiassa minun määritysteni mukaan), joista 331 BIN-lajia (Barcode Index Number, ks. Ratnasingham & Hebert 2013).
- Menetelmä erottaa pääosin eri lajit toisistaan, tai morfologian ja COI vaihtelun mukaan tehdyillä määrityksillä on suuri kongruenssi: lajin sisäinen vaihtelu on pientä (ka 1,48 %, todellisuudessa pienempi, koska mukana luvuissa on joitakin sukutasolle määritettyjä vaaksiaisia [esim. useita Tipula sp., jotka kuuluvat kahteen tai useampaan eri lajiin; BOLD tulkitsee nämä samoiksi lajeiksi ja laskee lajin sisäisen vaihtelun sen mukaan], sekä joitakin ehkä kontaminaatiosta johtuvia virheitä) ja lajien väliset erot melko suuret (keskimääräinen ero lähimpään lajiin 7.16 %) (Kuva 2). Useimmissa tapauksissa Suomesta kerättyjen yksilöiden lajinsisäinen vaihtelu oli erittäin pieni, alle 0,5 %.
Kuva 3. Ote suvun Prionocera (heimo Tipulidae) Neighbour Joining (NJ)-puusta. Neljän erillisen ja "hyvän" lajin ryhmä (subserricornis - woodorum) tulkitaan BOLDin analyysityökalun mukaan samaksi lajiksi (tai BIN-ryhmäksi).
Mielenkiintoisia havaintoja
Mielenkiintoisia havaintoja
- Vaaksiaiset, joilla poikkeavan suuri lajinsisäinen ero Suomesta kerättyjen yksilöiden välillä (kaksi BIN:a samalle lajille, eli BOLDin analyysityökalun mukaan kyseessä voi olla kaksi eri lajia): Ormosia lineata, Cheilotrichia neglecta, Dicranota gracilipes, Limonia badia, Rhipidia maculata, Dicranomyia mitis ja Nephrotoma flavescens. Näistä Rhipidia maculata on ehkä mielenkiintoisin, koska ero kahden sekvensoidun yksilön välillä on hyvin suuri, 10 %, muissa tapauksissa erot ovat pienemmät (2,2,- 3,5 %), mutta silti yli tavanomaisen lajinsisäisen vaihtelun.
Dicranomyia mitis on tapaus erikseen: minun BOLDiin lähettämät "mitis"-yksilöt eivät ole edes toistensa läheisimmät taksonit (ero peräti 54 %). Dicranomyia mitis-ryhmä on erittäin vaikea ja sisältää useita kuvaamattomia eurooppalaisia lajeja. Ormosia lineata-lajin yksilöt on kerätty samalta paikalta, samoin Limonia badia-lajin. En pitäisi todennäköisenä, että näissä tapauksissa olisi jotain taksonomista häikkää, eli piilolajeja. Nephrotoma flavescens-lajin tapauksessa on kolme yksilöä, joista kaksi ovat identtisiä. Kolmas yksilö on hieman epätyypilliseltä paikalta kerätty naaras (Someron Torronsuo), ja kyseessä voi olla väärä määritys tai tuntematon laji. BOLDin tietokannasta tehdyn haun perusteella joku muu on kuitenkin määrittänyt kaksi identtistä haplotyyppiä (eli samaa kuin minun naarasyksilöni Torronsuolta) lajiin N. flavescens. Suvun Nephrotoma taksonomia tunnetaan eurooppalaisten lajien suhteen erittäin hyvin, joten uuden lajin löytyminen tästä ryhmästä olisi lähes sensaatio; ehkä lisäselvittely olisi kuitenkin paikallaan. Cheilotrichia neglecta lajista on kaksi yksilöä, toinen Turusta ja toinen Kauhajoelta. Yksilöt voisi nyt vähintään ottaa tarkempaan syyniin ja etsiä mahdollisia morfologisia eroja niiden väliltä. Rhipidia maculata-lajin suuri lajin sisäinen ero perustuu kahteen yksilöön, jotka on kerätty Tervolasta ja Rautavaaralta. Kaksi muutakin yksilöä oli lähetetty BOLDiin, mutta niiden sekvensointi veti vesiperän. Muistan itse urani alkuvaiheissa huomanneeni pieniä eroja tämän lajin yksilöissä, mutta kuittasin sen silloin normaalina vaihteluna. Lisäyksilöitä on saatava sekä skoopin alle että viivakoodattavaksi. Dicranota gracilipes-lajin tapauksessa eroavat yksilöt ovat levinneisyyden ääripäistä, Käsivarren Lapista ja Pohjan Fiskarsista. Ero voi johtua siitä, että laji on levittäytynyt Suomeen jääkauden jälkeen kahdesta eri refugiasta ja geneettinen ero on muisto lajin vetäytymisestä erillisille "talvehtimisalueille".
- Vaaksiaiset, joilla suuri lajinsisäinen ero Euraasiasta ja Pohjois-Amerikasta kerättyjen yksilöiden välillä (samoin kuin edellä, BOLD ehdottaa kahta eri BIN-tunnusta samalle lajille). Dicranomyia ponojensis, Cylindrotoma distinctissima, Limonia nubeculosa ja Dicranomyia halterata.
Esimerkiksi lajilla C. distinctissima lajin sisäinen vaihtelu on keskimäärin 0,34 % (min 0, max 2,6%, n=29, yksilöitä Suomesta, Liettuasta, Kaukasukselta, Tatarstanista ja Venäjän Kauko-Idästä, mukaan lukien C. borealis joka on todennäköisesti distinctissima-lajin synonyymi). Pienin etäisyys euraasialaisen ja pohjois-amerikkalaisen yksilön välillä on 4,2 %. On vaikea sanoa, pitäisikö tämä ero tulkita lajien väliseksi eroksi vai lajin sisäiseksi vaihteluksi. Ehkä nykyinen käytäntö, jossa amerikkalaisia yksilöitä pidetään omana alalajinaan (C. distinctissima americana) on hyvä. Pitäisin mahdollisena, että euraasialaiset ja amerikkalaiset populaatiot eivät ole olleet yhteydessä viimeisimmän jäätiköitymisen aikaan, jolloin maasilta yhdisti mantereet. Eri mantereiden populaatiot ovat kenties viimeksi olleet yhteydessä miljoonia vuosia sitten, ja tänä aikana populaatiot ovat väkisinkin erilaistuneet.
- Pienet lajien väliset erot (kaksi tai useampia eri lajeja, joilla sama BIN): Ormosia pseudosimilis ja O. ruficauda, Dicranomyia didyma ja D. fuscinota, Diogma caudata ja D. glabrata, Prionocera subserricornis, P. turcica, P. abscondita ja P. woodorum, Erioptera pederi ja E. lutea, Ctenophora guttata ja C. pectinicornis.
Näissä kaikissa tapauksissa lajit klusteroituvat NJ-puussa (Kuva 3) omiksi ryhmikseen, mutta lajien väliset erot ovat sen verran pienet, että BOLD tulkitsee ne samoiksi lajeksi. Kaikki lajit ovat myös sellaisia, joiden aseman suhteen ei ole taksonomista epäselvyyttä. Tämä Prionocera-ryhmä on mielenkiintoinen, koska siinä peräti neljä lajia tulkitaan yhdeksi. Esimerkiksi lajien P. turcica ja P. abscondita välillä ero on 0,77 % (pienin ero) ja lajien P. abscondita ja P. subserricornis 1,24 % (suurin ero).
- COI ei erottele lajeja, tai lajit jakavat saman DNA-lajitunnisteen, eli lajit ovat sekaisin NJ-puussa vailla mitään säännönmukaisuutta: Metalimnobia tenua & M. quadrinotata, Dicranomyia caledonica & D. stylifera, Tipula moesta-ryhmä (3 lajia), Tipula hortorum ja T. nubeculosa.
Näistä lajipareista taksonomisesti ongelmallinen on ainostaan M. tenua ja M. quadrinotata, koska lajien väliset morfologiset erot ovat erittäin pienet. Mahdollinen syy sille, miksi COI ei erottele lajeja on ehkä ns. introgressio, eli geenejä on siirtynyt lajien välillä.
Muita havaintoja
Tipula nodicornis: siperialainen alalaji (T. n. platyglossa) voisi olla oma lajinsa, sillä ero lajien välillä on 9 %. Olin tehnyt joitakin vääriä määrityksiä, mutta onneksi aika pienen määrän, yhteensä viisi kappaletta (Erioptera tordi on ehkä vain sordida, yksi Limonia phragmitids yksilö on ehkä stigma, Nephrotoma quadristriata lienee lunulicornis ja yksi Tipula montium naras lienee coerulescens). Harvinainen, vuonna 2012 kuvattu Tipula recondita määrittyi DNA-lajitunnisteen perusteella Kolarista, olin onneksi laittanut oudon näköisen naarasyksilön mukaan analyyseihin. Tipula pauli löytyi maalle uutena lajina Turun Piipanojalta ja harvinaisesta Tipula jutlandica-lajista löytyi ensimmäinen varma naarasyksilö. Lisäksi Jaroslav Stary määritti kaksi Suomelle uutta lajia DNA-lajitunnisteiltaan poikkeavista yksilöistä (Dicranophragma adjunctum, Eloeophila mundata). Turun Piipanojalta löytyi useampi yksilö Molophilus-lajia, joka ei ole mikään Suomesta tunnettu laji; harmi vain, että kaikki yksilöt ovat naaraita, niiden määritys morfologian perusteella on mahdotonta. Samalta paikalta keräsin myös Rhypholophus toukkia, jotka eivät DNA-lajitunnisteen perusteella kuulu kumpaankaan Suomesta tunnettuun lajiin R. varius tai R. haemorrhoidalis.
Mitä seuraavaksi?
Tässä olisi hyvä aineisto käsiteltäväksi ja jalostettavaksi, ja tietysti hieman täydennättäväksi. Itselläni ei ole aikaa eikä tarvetta yksinäni värkätä aineistoa julkaisuksi saakka.Tarjoaisin tästä esim. opinnäytetyötä jollekin halukkaalle tyypille. Hieman lisää dataa joistakin yllä mainituista ongelmallisista tapauksista, ehkä tuman geenien sekvensoimista, morfologisten erojen etsimistä ja muuta sellaista. Ota yhteyttä, jos työläs mutta palkitseva tutkimusaihe kiinnostaa. Ja jos saat hankituksi toisen ohjaajan, joka ihan oikeasti tietää jotain molekyylisystematiikasta, toisin kuin minä.
Tässä olisi hyvä aineisto käsiteltäväksi ja jalostettavaksi, ja tietysti hieman täydennättäväksi. Itselläni ei ole aikaa eikä tarvetta yksinäni värkätä aineistoa julkaisuksi saakka.Tarjoaisin tästä esim. opinnäytetyötä jollekin halukkaalle tyypille. Hieman lisää dataa joistakin yllä mainituista ongelmallisista tapauksista, ehkä tuman geenien sekvensoimista, morfologisten erojen etsimistä ja muuta sellaista. Ota yhteyttä, jos työläs mutta palkitseva tutkimusaihe kiinnostaa. Ja jos saat hankituksi toisen ohjaajan, joka ihan oikeasti tietää jotain molekyylisystematiikasta, toisin kuin minä.
Ei kommentteja:
Lähetä kommentti